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杂色曲霉素检测

发布时刻:2018-12-14 19:30 作者:周世红 0
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杂色曲霉素是由杂色曲霉、构巢曲霉等发作的有毒代谢产品。该毒素是致癌物质,首要污染大米、玉米、小麦等谷物和花生、黄豆。杂色曲霉毒的化学结构式如图21—1。

杂色曲霉素为淡黄色结晶,分子式为C18 H12O6,分子量为324。在紫外光灯下具有暗砖赤色荧光。杂色曲霉素溶于极性弱的溶剂中,如三氯甲烷或比三氯甲烷极性更弱的溶剂,微溶于许多其他溶剂,不溶于水。由于毒素带酚羟基,羟基在必定的条件下发作水解而影响对光的吸收功用,当用分光光度法测定毒素时必定影响成果,故实验时有必要留意酸和溶剂。目前我国还没有拟定杂色曲霉素的卫生规范,选用的剖析办法首要是薄层色谱法和高效液相色谱法。但高效液相色谱法的回收率和检出极限均不抱负,现介绍薄层色谱规范检测办法。

一、适用规模

本办法适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食物中杂色曲霉素的测定。

二、原理

样品中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层打开后,用三氯化铝显色,再经加热发作一种在紫外光下显现黄色荧光的物质,依据其在薄层上显现的荧光最低检出量来测定样品中杂色曲霉素的含量。

三、试剂

1、三氯甲烷;

2、正己烷或石油醚(30~600C或60~900C);

3、甲醇;

4、苯;

5、冰乙酸;

6、甲酸;

7、95%乙醇;

8、4%氯化钠溶液;

9、20%三氯化铝-乙醇溶液:称取20g三氯化铝(A1C113·6H2O),溶于100mL乙醇中,过滤,室温保存;

10、杂色曲霉素规范溶液:用杂色曲霉素规范品制造成每毫升适当于lOμg的苯溶液。用紫外分光光度计标定其浓度(最大吸收峰的波长325nm,分子量324,摩尔消光系数15200),并作硅胶薄层色谱纯度判定,避光,放置于40C冰箱中保存;

11、杂色曲霉素规范运用液:用苯将10μg/mL的杂色曲霉素规范溶液稀释成每毫升适当于l和0.4μg的杂色曲霉素溶液。避光,放置于4℃冰箱中保存。

四、仪器

1、小型粉碎机;

2、样筛;

3、电动振动器;

4、全玻璃浓缩器;

5、玻璃板:l0cm×10cm与10cm×18.5cm两种;

6、打开槽:内长10cm、宽4.5cm、高17cm与内长11.5cm、宽60cm、高19cm;

7、喷雾器;

8、空气泵或油泵;

9、紫外光灯:波长365nm;

10、微量注射器。

五、操作过程

(一)样品溶液的制备

称取20g过20目筛的大米、玉米、小麦及黄豆样品(花生样品过10目筛孔),置于具塞锥形瓶中,加80mL甲醇-4 %氯化钠水溶液(90+lO),振动30min,过滤。搜集样液40mL(黄豆、花生样品则取20mL,参加20mL提取剂),移入250mL分液漏斗中,再参加25mL4%氯化钠溶液(使甲醇与水之体积比为55:45)和25mL石油醚,振摇2min,静置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中,基层溶液仍移入原分液漏斗中,再用25mL石油醚提取一次。最终将两次上层的石油醚溶液兼并,参加25mL甲醇-4%氯化钠水溶液(55+45),振摇30s[黄豆、花生样品则参加25mL甲醇-4%氯化钠溶液(70+30),振摇30s],将基层并于原甲醇水层中,重复用甲醇-4%氯化钠溶液(55+45)提取两次[黄豆、花生样品重复用甲醇-4%氯化钠溶液(70+30)提取一次],以提取该层的杂色曲霉素。基层溶液兼并后加30mL三氯甲烷(黄豆、花生样品除加三氯甲烷外,再加13mL4%氯化钠溶液,使甲醇与水的体积比为55:45)振摇2min,静置。待上层混浊液有部分澄清时,即可将基层溶液经放有约10g无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加10mL三氯甲烷,重复提取一次,将该基层溶液和用少数三氯甲烷洗滤器的洗液同时放入蒸发皿中。将蒸发皿置于65℃水浴上挥干,然后再在冰浴上放置2~3min,加1.OmL苯将残留物充沛混匀,置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中,于65℃用减压吹气法浓缩至干,参加1.OmL苯,供色谱测定,此1mL大米、玉米及小麦样液各适当于10g样品,1mL黄豆与花生样液则各适当于5g样品。

(二)薄层色谱测定

1、薄层板的制备:称取5g硅胶G,加适当于硅胶量2~3倍左右的水,用力研磨1~2 min至成糊状后,当即倒于涂布器内,铺成10cm×10cm、厚度0.3mm薄层板五块。

2、点样:取两块10cm×10cm薄层板,在距板下端各0.8~1cm基线上滴加规范运用液与样液如下:距左边际0.8~1cm处各滴加10μL0.4μg/mL规范运用液,在距左边际4cm处各滴加80μL样液(黄豆、花生样品为40μL),然后在第二块板的样液点上加滴10μL O.4μg/mL规范运用液,在滴加样液时可用吹风机凉风边吹边加。

3、打开:

(1)打开剂

横展剂:乙醚一正己烷一苯一三氯甲烷一甲酸(3+9+1.5+1.5+O.6)15.6 mL(由于此混合液不成一相,每一打开槽的用量须独自制造)。用前充沛摇匀,同时倒入槽内运用。

纵展剂:苯-甲醇-冰乙酸(90+8+2或92.5+6+1.5)15mL。同时倒入槽内运用。

(2)横向打开:将接近规范点的一边放入盛有横展剂的槽内,展至9cm左右取出挥干。

(3)纵向打开:将接近规范点与样品点的一边放入盛有纵展剂的槽内,打开9cm左右取出挥干。

4、显荧光:在薄层板上喷20%三氯化铝-乙醇溶液,置80℃,加热10min,当即在紫外光灯下调查成果,待薄层板冷却后再薄薄地喷第2次(不需

5、调查与鉴定:在紫外光灯下调查,若第二块板的第二点在规范点的相应处呈现最低检出量,而在榜首板的相同方位上未呈现荧光点,则样品中杂色曲霉素含量在5μg/kg以下(黄豆、花生样品为20μg/kg);若呈现荧光点的强度与规范点的最低检出量的荧光强度持平,并且此荧光点又同第二板样液的规范点堆叠,则样品中杂色曲霉素含量为5μg/kg(黄豆、花生样品为20μg/kg);若呈现荧光强度比规范点的最低检出量强,则依据其荧光强度估量削减滴加微升数,或将样液稀释后再滴加不同微升数,直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度共同停止。在喷三氯化铝榜首、二次后别离进行调查鉴定,两次成果应共同。若成果为阳性,则将薄层板放暗处10 min,再调查一次,如样品仍为阳性,进一步做确证实验,即在距薄层板(10cm×18.5cm)F端3cm的基线上滴加一个点的10μL O.4μg/mL规范运用液与3个点的样液,每点16μL。在样液的一个点上再加滴10μLO.4μg/mL规范运用液,另一点上再加滴10μL lμg/mL规范运用液。于各点上再加一小滴三氟乙酸,放暗处反响10min,热风吹5min,使薄层板上的温度不高于400C,用冰乙酸一苯(10+90)打开1~2次,直至杂色曲霉素衍生物与杂质分隔停止。打开时要避光,以下显荧光过程同“(4)显荧光”项下。最终将板在紫外光灯下调查,如样液为阳性,应发作与杂色曲霉素规范堆叠的衍生物。确证法的灵敏度:大米、玉米、小麦为25μg/kg(黄豆、花生样品为50μg/kg)。

6、核算:

式中:X——杂色曲霉素含量,μg/kg;

 V1——样液浓缩后体积,mL;

V2——呈现最低荧光样液的滴加体积,mL;

D——浓缩样液的总稀释倍数;

m——浓缩样液中所适当的样品质量,g;

0.004——杂色曲霉素的最低检出量,μg。

六、留意事项

(一)在大米、玉米或小麦样品中参加杂色曲霉素5μg/kg时(黄豆、花生样品中参加水平为20μg/kg),用双向薄层色谱法测定,杂色曲霉素的回收率均达75%mL,故以为用本办法测定大米、玉米及小麦的办法灵敏度为5μg/kg,黄豆、花生则为20μg/kg。做样品中杂色曲霉素回收率时,须先将所需的杂色曲霉素规范液参加预备称样的具塞锥形瓶中,以吹风机用凉风将规范液的溶剂吹干后,再将样品参加,以下操作办法与样品测定相同。

(二)在薄层色谱上喷以三氯化铝乙醇溶液,使杂色曲霉素分子结构上的酮基与羟基和铝离子结组成络合物后,发作黄色荧光,其荧光强度较杂色曲霉素自身具有的暗砖赤色荧光约进步100倍。

(三)由于杂色曲霉素微溶于石油醚,所以还需用甲醇-4%氯化钠溶液提回石油醚层中微量的杂色曲霉素。

(四)打开剂用量随打开槽巨细而定,用量要适宜,过多的打开剂会将板上的点浸泡在打开剂中。

(五)薄薄地喷第2次三氯化铝一乙醇溶液,其效果能消除板上弱小的底色。

(六)由于在薄层色谱上用目视能区别与杂色曲霉素最低检出量相差±20%剂量的荧光强度,因而用目视定量的差错规模为±20%左右。

(七)在200多份的样品测定中,有一份在薄层色谱测定中样液在规范相应处呈现相似杂色曲霉素的荧光点,但此点在暗处过10min后即消失,因而如为阳性样品,须将板在暗处放10min后再调查一次,以防止样品的假阳性。

参考资料:食物卫生微生物查验规范手册

 

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